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【深度热点】细胞融合的方法、过程和影响因素

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2019-01-30 15:56
来源:实验与分析
实验与分析
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  由于对新生物资源需要、淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备,以及寻求远缘物种间的遗传物质交换的新途径,细胞融合技术现在已经成为生命科学里最热的话题之一,那么,细胞融合的方法就是细胞融合的关键。

  细胞融合的概念

  细胞融合(cell fusion):又称somatic hybridization or cell hybridization ,指在自然条件下或人工方法使两个或两个以上的细胞通过无性方式融合形成一个杂合细胞的过程。

  它能重新组合两个亲本细胞的优良遗传信息,是研究细胞间遗传信息传递、基因在染色体定位、改良动物遗传特性及创造新的符合人类需要的新的细胞系极为有效的手段。

  细胞融合机理

  细胞融合的关键:脂双层的接触靠近, 细胞桥形成, 胞质渗透-细胞核融合。

  细胞融合的方法

  1.自发融合

  自发细胞融合是在未施加任何诱导条件的情况下所发生的细胞融合现象。

  2.诱发细胞融合

  (1)病毒促进细胞融合

  病毒类融合剂是研究的最早的促融剂,一些致癌、致病病毒如疱疹病毒、天花病毒、副流感型病毒、副黏液病毒等,都能诱导细胞融合,但由于毒性大,应用上收到很大限制。

  仙台病毒(HVJ)是一类被膜病毒,诱导细胞融合的不是仙台病毒内部的RNA,而是它的外膜。

  HVJ促融机制:

  当病毒位于两个细胞间时,病毒表面spike上神经氨酸酶降解细胞膜上的糖蛋白,使细胞膜局部聚集在病毒周围,在高pH和Ca2+条件下局部细胞膜发生融合。

  (2)化学融合剂促进细胞融合

  PEG(polyethylene glycol,PEG)可促进细胞融合,PEG是一种多聚化合物,商品名卡波蜡Carbowax,靠醚键的联结使其分子末端带弱负电荷,目前已衍生达50多种。

  原理:PEG带有大量的负电荷,和细胞膜表面的负电荷在Ca2+的连接下,形成静电键,促使异源的细胞膜间的粘着和结合,在高pH,高Ca2+溶液的作用下,将Ca2+和与质膜结合的PEG分子洗脱,导致电荷平衡失调并重新分配,使两种细胞膜上的正负电荷连接起来,进而形成具有共同质膜的融合体。

  PEG诱导融合的优点:

  1.融合成本低无需特殊设备;

  2.融合子产生异核率特别高;

  3.融合过程不受物种限制。

  缺点:

  融合过程繁琐,PEG可能对细胞有毒害。

  注意事项

  1、PEG融合的关键是作用时间

  2、PEG规格和纯度与融合效率有关

  3、融合与细胞密度有关

  4、融合液中加入少量CaCl2,即维持一定电导率,对细胞也有保护作用

  (3)电融合技术

  使细胞膜具有通透性,让外界的分子扩散入胞液中以外,高强度的电场脉冲也能引起细胞融合,这一现象叫做电融合。

  融合原理

  首先,通过双向电泳使细胞间的接触变得非常紧急。普通电泳采用直流电来移动分子,双向电泳则与之不同,采用了高频交流电。在活细胞等微粒的内部,诱导去极化,引起细胞聚集,排列成串珠状,互相紧密接触。

  然后给予短暂的高压脉冲,引起细胞膜的穿透,随后细胞膜发生结合导致细胞融合。为了稳定这个过程,在短期内需要施加交流电压。

  刚完成的电融合的融合细胞可称为异核体,因为尽管表面的细胞膜已经发生了融合,细胞内仍可以看到两个或两个以上的细胞核。随后,细胞核也会细胞内部发生融合。在多数情况下,该过程会导致核中的染色体数量急剧下降。

  细胞融合的过程:

  电融合的优点:

  1.不存在对细胞的毒害;

  2.融合效率高;

  3.融合技术操作简便。

  注意事项

  1.对介质要求高,一般用高纯度的蒸馏水并选用适当的非电介质溶液,如甘露醇等配制等渗性介质。

  2.注意控制高频交流电压和直流脉冲电压的强度和时间,以防止细胞连接成串或发生可逆性降解。

  细胞融合的意义重大,理论上说任何细胞,都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义;融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制,为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径;体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统,在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组,从而产生新的核外遗传系统;淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。从以上意义出发,都需要我们对细胞融合技术有一个正确、深入的把握。

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