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【深度热点】生物实验室的那些事 说多了都是精华!

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2018-01-03 09:35
来源:互联网
互联网
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  平时在实验室最常听到的一句话就是“今天某某试验没做好是为什么?今天某某试验没出结果是什么原因?今天某某试验为什么会是这样的呢?” 等等。然后仔细一查找原因,往往是由于操作上面的不认真,或是一些小小的细节没有注意到。以下是集各路朋网友的一些实战经验,在此与大家分享。

  1. 跑page胶的时候

  小电压跑会避免高电压产生的热量尔导致的胶层变形。低电压泳道会比大电压泳道跑的直一些,且分离效果更高,有利于分子量相差不大的蛋白分离。

  2. 提取质粒的时候

  最后一步的酒精挥发很关键,基本上是其后续的酶切反应的决定性因素。所以这一步尽量挥发长一点时间,最好是空调吹热风,或是37度温箱放长一点的时间,我试过室温过夜,酶切很好。

  3. 做WESTERN BLOT 的时候

  大家往往会摸索一抗、二抗的浓度,封闭时间,曝光时间等等,而每次变换其中的一个条件就需要从新跑胶、转膜,甚至重新提蛋白,这样会浪费大量的时间。其实完全没有必要这样。一次转膜后,将PVDF膜晾干,裁减成小块,保存起来,用的时候取出一块,没有任何影响。这对于摸索条件的战友来说,节约了大量的时间。

  4. 有关缓冲液和培养基配置

  1)将缓冲液配方中的成分分别以10-100倍配成母液储存,需要的时候只需将相应的母液混合,补加水稀释即可。

  2)配培养基时通常会忘记各成分的量,如配LB时的三个成分不记得到底哪个是5g,哪个要10个,因此可以在常用的试剂瓶的标签上注明所需的量,如配LB时,在NaCl瓶外注明10g/L, yeast 5 g/L, tryton 10 g/L等,很方便,不需要每次配之前临时翻书。

  5. 有关PCR主反应液配置

  在做克隆鉴定的时候经常需要在酶切鉴定前进行PCR鉴定,每次配置PCR反应液很繁琐,可以将其配置类似kit的形式,按你需要的反应体系列表,然后放大100倍配置100×主反应液(100次反应),其中含buffer,Mg2+,dNTPs,但不含引物和Taq酶,然后可以10×分装或一管储存在-20度,在需要的时候拿出融开,然后按所需的PCR反应个数吸取相应的倍数,再补加相应反应倍数的Taq和引物,混匀后分装,这样做的好处如下:

  1)可极大的节省宝贵的时间,可早点收工,看球;

  2)避免每次反应加样不均的可能;

  3)大大减少PCR假阳性的产生。

  6. 有关酶切反应液的配置

  在做酶切时,也可以象PCR一样配置主反应液,每次反应前先列好反应的体系,算好需要的反应数,然后按所需反应的体系按所需反应数放大,加入buffer、酶、水,质粒栏空缺,然后混合后按除质粒DNA的体积分装,然后再在每管中加入相应体积的质粒DNA酶切,这样做的好处如下,特别是当同时有10几个阳性克隆需要鉴定时尤为明显:

  1)各反应成分均一;

  2)可大大减少限制型内切酶的使用;

  3)节省时间。

  7. 有关SDS-PAGE:

  1)可将SDS-PAGE的积层胶,分离胶预先配好大体积如100ml储存在4度冰箱(注:10%AP,TEMED不加,切记!!!),每次配置时只需吸取相应体积的预制胶加入AP,TEMED即可,没必要每次制胶时候翻分子克隆,特别方便,而且,这样的预制胶可储存半年以上,不失为偷懒的绝佳方法;更关键的是可大大减少与丙稀酰胺的接触,因此大大减少中毒的机会。2)电泳时虽然小电泳分离效果要好一些,但2小时以上的等待的时间实在是痛苦,因此可以提高电泳至150V,但需要将整个电泳槽放在放满冰水的脸盆里散热,这样跑出来的胶分离效果丝毫不比低电压来的差,关键是时间大大节省,不需1h即可看结果了。

  8. 实验中小窍门

  能够分成两类:一类是“非常规”操作;一类是常规操作过程中一些省时省事手段。

  前一类,举个例子:有时候第一天涂的转化平板、次日早晨转化子可能长成的菌落比较大(1~2毫米以上,BL21就长得快),下一步转化子做质粒鉴定。这个情况下可以直接挑取一块菌苔(勿带出培养基),50微升酚/氯仿悬浮菌体,放置两分钟,加40微升TE抽提,上层TE吸出后再氯仿抽提一次,吸取上层TE即是质粒提取液。提取的质粒可以直接用于电泳和酶切。这样操作,可以省去转接液体试管的培养步骤,至少节省6~8小时的时间。但是,要在各步骤都控制得很好的情况下才能保证提取和酶切的效果,不同的实验室或者操作者未必能够很方便地重复----其实,其它的一些“小窍门”也是如此。

  后一类的小窍门则在实验室中无处不在。如:平行作不同样本的PCR,模板DNA加量一样,配置PCR体系可以一起配制后分装----这点做过试验的都知道,但是配制的时候配制量可以比预期分装量稍多一点(如用100微升则配110微升),这样可以避免有时候分装不够的尴尬,因为不同特别是大小不同的枪,会有误差。再比如:楼上有站友说的sds-page胶预配(APS和TEMED、或者后者先不加)的问题,实际上时间放置过长肯定影响效果,如果要在一天内连续地跑两次板,何尝不可?又比如,配sds-page胶的时候,上层胶和下层胶可以只用一个大枪头:先取胶,次取水,取6.8的tris后再取8.8的tris,省时省料。

  20021108站友开的这个帖子很好,在上上层楼的帖子说得也有道理。但我想,“窍门”和“偷懒”不应该是因果关系。其实,不管是那一类的小窍门,都是在充分地理解实验各步骤的原理、经过多次试验积累、再加上一点点思索然后尝试的结果。知其然知其所以然和勤于思考敢于探索,是根本。否则,别人的小窍门对你也未必能够有用。才进实验室的新手,务必要先练好规范扎实的操作,然后才能弄“窍门”。本末倒置,贻害无穷。

  9. SDS -PAGE的积层胶

  分离胶预先配成mixture,APS制胶时加入,半年内使用,绝对没有问题,我保证。

  10. 做SDS-PAGE的时候

  除了蛋白量上样一致,最好体积也一致,这样跑出来的胶各个泳道之间的band能做到一样宽,方便后面的比较,特别是WB。做法就是拿1X的上样缓冲补全要加的样做到体积一致,否则跑出来会有的宽有的窄,特别是上样体积相差较大的。

  11. 在把蛋白胶做成干胶时

  很多时候会因为有气泡使胶裂掉,我的经验是在做胶时加上层膜前在胶上多加些水就不容易进气泡了,还有就是高温烘胶,我喜欢放到60度烘箱里烘,这样水分蒸发速度快,即使有一些小的气泡也不会有影响,呵呵,这是经验之谈,我从来都没失手过,大家可以试试。

  12. 做大肠表达时

  确定蛋白是否表达一般要煮样做诱前诱后检测,但很多时候煮出来的很黏影响跑胶效果.我发现如果现用8M Urea重悬细菌再煮效果会有极大改善。

  注:不能用Gu-HCl代替。

  13. 我也推荐几个偷懒的方法

  1. 做SDS-PAGE跑胶通常都是现配现用,但配胶要>1h,所以如果想第二天睡个懒觉而又不耽误跑胶可以于前一天晚上做好浓缩胶和分离胶,待凝聚后不要拔下梳子,把含胶玻璃板从制胶槽取下,用保鲜膜包上,注意玻璃板上下两边缘会有气体,所以需要加一点电泳缓冲液以避免胶内水分蒸发.然后放4度过夜.第二天直接拔下梳子行后续.国外好多公司出售脚既是如此,可以保存上星期。

  2. 配置分离胶或者非变性胶时因胶凝时收缩可导致加样孔变浅.可以将加剩的胶放入4度以降低凝聚速度,而将凝胶放入37度促聚,并随时用4度加剩的胶补充下降的胶面.另外将胶横放与水平面成~10度角也可以减少收缩的影响。

  3.推荐一个节约抗体/时间的做法:

  同时跑2块胶,同时转膜,然后两块膜背靠背放入同一封口膜同时封闭,同时一抗二抗(最好是用转轮,这样效果好.如果是摇床,隔一段时间帮它们翻个身以保证两张膜的正面都有机会与液体充分接触.一起洗膜(可以稍微加强洗膜也可以不做.我最多一张盘子里放4张膜而没有影响洗膜).可分别或同时压片.这样就可以节约一半抗体和接近一半时间而不会影响结果。

  或者另外一个就是孵育后的抗体不要扔,好的抗体可以反复做好几张膜呢.但每次都会减弱,效果不如上面一种方法。

  14. 做western blotting 转膜时

  胶放在转膜缓冲液中一段时间,待胶在含有甲醇的缓冲夜中缩小的差不多后装 好转膜装置,我的经验是把膜印在胶上直接在膜上画出预染maker条带,方便的很。因为很多时候跑电泳时胶上的预染maker很清楚,等转膜后就不是分辨的很清楚了。不过要注意画好预染maker后就不要使胶和膜发生对位移动了,以防maker失去参照价值。

  15. 超滤最合适用于蛋白的浓缩,

  更换缓冲液和除盐,对于按照分子量进行初分离的效果不是很好,理论和现实是有很大差别的。

  16. 关于Western Blot

  1)器具的清洁非常重要,开始做前,为了安全,尤其是装胶的厚薄玻璃板,可以先用中性洗涤剂和自来水反复冲洗,确保无洗涤残液后用蒸馏水冲洗2-3遍,然后用去离子水冲洗一遍。最后用95%酒精再擦一遍后晾干备用。

  2)配胶最好现用现配,先配下层胶(分离胶),后配上层胶(浓缩胶或积层胶),而且在临灌胶前加APS并迅速混匀,即用移液枪抽吸与注入1-2次即可。

  17 跑蛋白page的时候

  一开始用加样针,太麻烦,发现用20ul枪+普通小白枪头点,非常省事。另外,点样时有可能看不清孔在哪,看远离你的那面胶,孔有反光的。点样也点你对面的那块胶,省的总低头,干咱这行的容易得颈椎呀,爱惜自己。

  18. 垂直电泳时,

  可在电泳糟中放入青霉素小瓶等,可自然使液面提高而不影响电泳,又很节约电泳缓冲液。

  19. 我们有时要沉淀东西时,

  由于沉淀量很少,离心完之后不知道到底有没沉淀下来东西,由于量很少,不好观察,所以离心时建议按特定的方向放置离心管,这样你就可以在离心之前确定沉淀该沉淀到管子的大致部位,这样离心后就可直接观察那有没有沉淀,避免满管子找,另外看沉淀时可以对光看,这样就是颗粒状的细小沉淀也能看见的。

  20. 大家都知道PMSF有剧毒,

  以前都是知道浓度和要配的体积的基础上,算出要称多少毫克的PMSF,其实也可以先称PMSF,称多少算多少,再调整异丙醇的体积,到达你所要的浓度。这样就避免了你长时间和它接触。

  21. 跑好SDS-PAGE胶的一些体会:

  1. 清洗好玻璃板,不要偷懒,很多时候跑完电泳撬胶时会因为玻璃板不干净胶粘在板上把胶撬破。

  2. 配胶时不要反复用枪混,稍微摇混就可以了,用枪混多次会导致胶凝不好影响电泳图的分辨率。

  3. AP分装成500微升一管保存放-20度,避免AP用太久失效。

  4. 倒胶时把玻璃板中的水用滤纸尽量吸干,因为微量的水存在会影响配的胶浓度。

  5. 尽量不用过夜放室温或者四度的胶,也回影响胶 的分离效果。

  6. 电泳完撬胶时根本不需要用撬胶板,在一平皿里装好水,把有胶一面的放在水中晃动几次胶很容易就脱落下来,一点没有问题,方便的很。

  7. 点样时样品别忘了离心这步,因为上样含有固体沉淀会影响电泳图分辨效果。

  8. 尽量在冰浴状态下跑。

  22. 关于2-DE

  总结了几个小窍门:

  1.一向电泳时,盐离子容易聚在 胶槽的两侧.剪一小段IPG胶条放在两侧,构成盐桥,电压就容易上去了。避免一向电泳不好影响最后实验结果。

  2. SDS-PAGE时,在灌胶之前,一般大家都会用凡士林封底, 在SDS-PAGE电泳之前又必须把凡士林搽干净,很是麻烦,我的经验是:不用凡士林,取少量未加Ap的分离胶,按比例加2倍量的Ap,然后灌入板间,等上几分钟,待胶凝固后就可以接着灌分离胶方面,效果好!

  23. 蛋白质纯化时

  蛋白质降解可能与超声破菌保持冰浴有关,之前建议加pmsf,建议在上柱子洗脱的时候也加pmsf(蛋白降解抑制剂),一定要用之前再加。

  24. 做透析的时候,

  拿一个5ml的枪头或者是其他类似的东西,剪短,穿过个塑料泡沫之类的面积比烧杯大东西,然后把透析带一端扎紧,另一端开口绑紧在5ml枪头下端,扎紧得那端也可以弯过来绑成u字型。这样就可以用1ml的枪穿过5ml的枪头的孔,另一只手调整透析带,来加样取样,省去了总绑透析带的麻烦,对同一个蛋白大量多次透析非常方便

  25. 自己的实验技巧:

  1. 配SDS-PAGE胶时,用枪头混匀比较麻烦,而且费时费力,效果也不好。可以剪一小段夹文件的那种曲针做转子放到配胶的小烧杯里,在磁力搅拌器上边搅边加入各溶液,这样加完也就混匀了,直接灌胶即可。

  2. 上面的站友也说过,上样用黄枪头就行,我也一直在用,根本不用注射器,方便的很,建议大家也试试。

  3.电泳后考马斯亮蓝染色一般要1h到2h,脱色也要2h左右,麻烦的很。现在给大家说一个简单的方法,是我从一个师姐那里学到的。加入染色液后,先放入微波炉里加热5-10秒,使染色液微热即可(千万不要加热太久,否则冰醋酸就挥发了)。然后放水平摇床上摇20分钟,最多半小时就染好了。

  脱色也很简单,不用脱色液,直接用去离子水,放微波炉里煮沸5分钟左右,然后将水倒掉,再换上新的去离子水煮,这样反复几次,就可以了。效果可能比正常的脱色稍差一点点,不如那样清楚,只要电泳时比平时多上1/5的样品就可以了,关键是这样省时省材料(用不着含甲醇和冰醋酸的脱色液)。

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