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【色谱】保留时间漂移 该如何是好?

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2018-02-09 13:59
来源:实验与分析
实验与分析
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  保留时间不重现有两种不同的情况:即保留时间漂移和保留时间波动。前者是指保留时间仅沿单方向发生变化,而后者指保留时间无固定规律的波动。

  将此两种情况区分开来对找到问题的原因往往很有帮助。事实上,保留时间漂移的多半原因是不同机理的色谱柱老化,如固定相流失(例如通过水解),色谱柱污染(由样品或流动相所致)等。

  保留时间漂移突然增加或减小

  保留时间漂移是指在连续的运行中保留时间持续地增加或者减少。在一系列分析运行中,保留时间突然增加,原因可能是载气流速或柱箱温度的问题;检查设定值是否正多次进样穿刺后隔垫漏气也是一个可能的原因。如果发生这样的情况,就要在运行分析之前更换隔垫。

  而如果保留时间突然减小,这很有可能是柱箱温度或者载气流速设定值改变引起的。

  保留时间漂移的最常见原因如下

  1.色谱柱平衡

  如果我们观察到保留时间漂移,首先应考虑色谱柱是否已用流动相完全平衡。通常平衡需要10-20个柱体积的流动相,但如果在流动相中加入少量添加剂(如离子对试剂)则需要相当长的时间来平衡色谱柱。

  流动相污染也可能是原因之一。溶于流动相中的少量污染物可能慢慢富集到色谱柱上,从而造成保留时间的漂移。应注意:水是很容易污染的流动相成分。

  2. 色谱柱污染

  保留时间漂移的另一个常见原因是色谱柱污染。HPLC色谱柱是非常有效的吸附性过滤器,它可以过滤并吸附流动相携带的任何物质。污染源可以是:流动相本身,流动相容器,连接管、泵、进样器和仪器密封垫,以及样品等。通常通过实验可判断污染的来源。

  样品中如果存在色谱柱上保留很强的组分,就可能是使保留时间漂移的潜在根源。这些根源通常是样品基质。如:食品样品中的淀粉,环境水样中的腐殖酸等。通常样品中的强保留组分具有较高的分子量,在此情况下,保留时间漂移的同时或其后会有反压的增加。可以通过使用固相提取(SPE)等样品前处理方法来去除样品基质的影响。

  避免色谱柱污染最简单的方法是防患于未然。相比之下,找到问题的所在并设计有效的清洗步骤以去除污染物要困难的多。通常使用在给定色谱条件下的强溶剂,但并非所有污染物都可以在流动相中溶解。如THF可去除反相色谱柱中的许多污染物,但蛋白在THF中就不能溶解。DMSO常常用于去除反相色谱柱中的蛋白。

  使用保护柱是个非常有效的方法。反冲色谱柱仅是不得已时采用的办法。

  3.流动相组成

  流动相组成的缓慢变化也是保留时间漂移的常见原因。如流动相中易挥发组分的挥发及循环使用流动相等。

  常见案例分析:

  我的色谱峰保留时间在漂移。。。

  大多数人通常假设保留时间的漂移是平衡问题。如果你在使用未修饰的硅胶柱做正相色谱,那么这是最可能发生的问题。正相色谱的保留时间容易受到硅胶表面吸附的水含量的影响,然后是溶解在流动相中的水的作用。因为水在正己烷或二氯甲烷等试剂中的溶解度非常低,所以色谱柱平衡需要很长时间。

  我曾见过使用非常干燥的正己烷平衡一星期后保留时间仍然漂移的情况,所以建议避免使用非常干燥的试剂。通常解决硅胶和水的平衡问题的办法就是使用与水“半饱和”的试剂。制备方法是把1体积的疏水试剂用水饱和后,再与相同体积的“干燥”试剂混合。这个方法可以极大的加快平衡时间。

  流动相含有低浓度的强吸附剂 会导致保留时间漂移么?

  强吸附剂也可能源于样品,这种情况下它们在重复进样中会慢慢累积,从而改变色谱柱的化学性质。举个例子,药品中的赋形剂。 我们可以通过观察保留时间变化的速率来得知杂质是从流动相中引入还是从样品中引入。

  实验如下:

  1. 进样几次,例如,4次一共1小时进样。

  2. 走相同量的流动相,不进样。

  3. 重复第一步

  4. 做一个关系图,保留时间 a. 对时间的关系 b. 对进样次数的关系。如果第一个图得到一条平滑的曲线,那么流动相是引入杂质的原因。如果第二个图得到一条平滑的曲线,那么杂质的来源是样品。

  其它保留时间漂移的原因?

  如果流动相的组成随着时间改变,那么就有可能导致保留时间漂移。如果你没有使用仪器的在线混合装置,那么流动相的组分可能在缓慢的蒸发。当你用氦气流喷射流动相的方法赶气泡的时候,你必须控制喷射的速率最小。

  此外,一个经常被忽视的原因就是键合相的水解。制造商通常会指定一个PH范围,超出范围可能导致键合相“不稳定”。这个范围通常是PH2-8或9。然而,人们会有很多原因不得不接近这个极限。这不是一个明显的分界线,因为水解也会取决于其他因素如温度或有机溶剂,但是缓慢的水解会在这个极限上发生。

  要保持固定相的水解稳定性,最好是在中性PH值,低温下3-5左右,等度条件好于梯度条件。当等度条件下发生水解时,键合相通常会自我吸附,达成一种区域平衡。然而,在使用高浓度的有机溶剂时,例如在梯度洗脱或者冲洗色谱柱的过程中,这种平衡被打破,键合相会被冲洗出色谱柱。

  温度能导致保留时间漂移么?

  是的,温度通常是有可能的。如果你的样品是自动分析过夜或者过了周末的,那么你得到的保留时间漂移的结果可能和实验室温度变化有关。在许多地方,室温的设置在晚上或者周末通常是不一样的。通常来讲,1℃的变化导致保留时间漂移大约1%到2%。这个可以联系最后一个导致保留时间漂移的原因-色谱柱返压的增加。增加的返压表明色谱柱被污染,但是仅仅是污染的塞板还足以影响保留时间。压力会让流动相通过塞板时产生比正常情况大的摩擦,导致流动相受热,这个增加的温度会导致保留时间的漂移。

  此外还有其他的一些原因,但是极少发生。

  在反相色谱上发生平衡很慢的现象是由于流动相中有机溶剂比例太少。高键合覆盖率、“完全封端”的C18没有被流动相良好的“湿润”。这会导致一些现象,如流动相和固定相失去联系造成的“疏水塌陷”,这是由于固定相之间的相互吸附,从而导致可用于和样品相互作用的表面积的减少。这时候立即用一定量柱体积的有机溶剂冲洗可以使色谱柱再生,最好是在你的流动相中加入有机调节剂。这类现象在所有没有被封端的固定相上很少发生,甚至不会遇到。

  小结

  有数据显示,随着实验的进行,同一组分的保留时间会呈现上升的趋势。除了仪器、试剂等本身的故障带来的保留时间漂移问题,实验室温度以及环境大气压的变化也会导致保留时间漂移,因此,每天的实验室温差应控制在3℃以内,避免阳光直射。

  同时,仪器周围要留有足够的散热空间。 固定液缓慢流失也会缩短样品的保留时间。当使用温度接近色谱柱的使用温度上限时,一旦载气脱氧不彻底,就会出现固定液分解加速,样品保留时间缩短的情况。因此应将柱温控制在使用范围内,并且应定期更换除氧净化器。 当柱头被污染时,污染物将延长样品的保留时间。最好将柱头被污染的部分切除,提高样品的净化程度,或者采用顶空进样等技术,以减少对色谱柱的污染。

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