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【深度热点】用于无标记蛋白质分析的高通量系统

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2018-11-21 10:12
来源:实验与分析
HendrikWünsche和Dirk Sievers * / Marc Platthaus
302

  蛋白质分析寻找不需要检测剂的技术。使用无微流体的系统越来越多地被使用,这些系统承诺更容易处理,更快的测量和更大的数据集。

生物层干涉测量法是一种无标记的快速实时蛋白质分析方法。

  生物层干涉测量遵循基于光波叠加的光学干涉测量原理。使用具有特定的表面改性,以在传感器的前端基于光纤的BLI生物传感器使得能够白色光(包括可见光谱的所有波长)通过光纤来传输向下和反射在所述光的一部分返回到该系统的两个表面。这是玻璃纤维和生物相容层之间的界面以及传感器尖端(附有任何样品)和溶液之间的界面。当分子结合到生物传感器的表面时,该第二反射的路径长度增加。

图1a:用于无标记蛋白质分析的BLI装置系列

图1a:用于无标记蛋白质分析的BLI装置系列

  对这两个反射的叠加的波长特定考虑,即作为波长的函数的相对强度的曲线图导致特定的干涉图案,其形成BLI测量的基础。由于分子与传感器表面的结合,该干涉测量曲线发生偏移。与传感器表面结合的分子越多,这种效应就越强。类似地,一旦分子从表面解离,就可以观察到干涉测量分布在相反方向上的偏移。该变化与时间的曲线图提供了经典的缔合 - 解离曲线,其中结合速率/解离速率(开/关速率,k a,k d)并且可以在不使用检测剂的情况下实时确定亲和常数(K D)。

图1b:......具有特定表面的光纤生物传感器

图1b:......具有特定表面的光纤生物传感器

图1C:在结合的分子的依赖两个界面处的反射的波长的叠加。

图1C:在结合的分子的依赖两个界面处的反射的波长的叠加。

  福特生物器件系列

  自2005年以来,BLI技术已经在Fortebio系统中投入商业使用,Fortebio现在是颇尔生命科学公司。Pall Fortebio Octet系统用于96孔或384孔格式的生物分子相互作用的无标记分析。自2012年以来,Pall Fortebio手动闪光系统作为低样本应用的便捷替代品得到了补充。

  所有系统都能实现实时蛋白质测定以及实时滴读 - 完成亲和力和动力学,其特点是易于使用,速度快,经济。该系统可用于蛋白质研究中的许多工艺步骤,包括柱馏分分析,质量控制和蛋白质表达研究。

  Pall Fortebio平台凭借其高效的工作流程,可以轻松快速地表征新的药物发现和药物开发候选药物,其中传统的耗时程序在较高的样品通量中受到限制并产生巨大的成本。

图2:实时生物层干涉测量法优于ELISA方法

图2:实时生物层干涉测量法优于ELISA方法

  抗体开发和生产中的常见应用是通过ELISA(酶联免疫吸附测定),免疫组织化学或Western印迹筛选杂交瘤上清液。例如,来自单菌落孔的上清液中人IgG的定量允许选择具有最高抗体产生率的细胞系。此浓度确定为哪些还没有有效的方法,现在可以通过与特定的抗人Fab-CH1-生物传感器和相应的IgG标准系列定量快速两分钟帕尔福特生物八位组协议来完成。识别所有人IgG亚型,而未结合游离轻IgG链或重链的人Fc部分。

  抗体浓度的快速分析也是色谱级分,细胞培养试剂或生长因子测试的重要标准。在引入Pall Fortebio平台之前,需要亲和纯化单个样品以确定抗体浓度。

  根据具体应用,可获得用于IgG定量的替代生物传感器,包括蛋白A,蛋白G和蛋白L以及其他人和小鼠特异性修饰。此外,一些试剂盒和方法可用于检测低亲和力抗药物抗体(ADA),残留宿主细胞蛋白(HCP)的检测以及残留蛋白A的检测。

  定制分析物的定量可以通过使用者用链霉抗生物素蛋白(SA)生物传感器或胺反应性(AR2G)生物传感器固定其选择的配体来完成。通过这种方式,可以在Pall Fortebio系统上将ELISA方案转换为更有效的BLI浓度测定方法。消除了ELISA方法所需的频繁洗涤步骤。结果更精确地实现(变异系数,CV <10%)并且更快。此外,还可以通过Pall Fortebio测定法分析未处理的原始样品。

  无标记动力学测定

  对高质量,高特异性抗体的不断增长的需求需要优化常规杂交瘤生产方法。该过程优化需要筛选方法,其在早期阶段更有意义地表征抗体 - 抗原相互作用。使用ELISA方法作为经典终点技术仅提供有限的信息,其有助于鉴定具有高结合亲和力的抗体。此外,还存在来自检测剂的不希望的干扰的风险。在所需的洗涤步骤中也可以除去低结合亲和力抗体,因此它们不能通过ELISA表征。

图3:表位分箱在5小时内快速筛选16x12基质中的192对抗体,每个测量周期25分钟。

图3:表位分箱在5小时内快速筛选16x12基质中的192对抗体,每个测量周期25分钟。

  相反,无标记筛选方法实时提供关于抗体 - 抗原相互作用的详细动力学信息,允许可靠地确定抗体对特定抗原的结合亲和力。不像ELISA中的方法近似的亲和常数(K d,使标记筛选方法提供的值),亲和常数(K的确定d值)和结合率/ Disssoziationsraten(开/关比率,K 一个中,k d)。这是特别重要的,因为不同的缔合和解离速率可以给出相同的亲和力常数(参见图2)。该技术还可以非常成功地用于来自未处理或清洁样品的表位作图或表位装箱。这些竞争性结合测定鉴定了与抗原的相同或重叠表位结合的IgG对(参见图3)。

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