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【其他分析技术】PCR仪常见问题及回答

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2017-09-29 16:54
来源:仪器设备行业网
互联网
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  聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点,是能将微量的DNA大幅增加。因此,无论是化石中的古生物、历史人物的残骸,还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液,只要能分离出一丁点的DNA,就能用PCR加以放大,进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。由1983年美国Mullis首先提出设想,1985年由其发明了聚合酶链反应,即简易DNA扩增法,意味着PCR技术的真正诞生。到如今2013年,PCR已发展到第三代技术。1973 年,台湾科学家钱嘉韵,发现了稳定的Taq DNA聚合酶,为PCR技术发展也做出了基础性贡献。

  一.遇到的问题

  1. cDNA产量的很低

  可能的原因:

  RNA模板质量低

  对mRNA浓度估计过高

  反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足

  同位素磷32过期

  反应体积过大,不应超过50μL

  2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅

  最常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系

  与反应起始时RNA的总量及纯度有关

  建议在试验中加入对照RNA

  第一链的反应产物在进行PCR扩增时,在总的反应体系中的含量不要超过1/10

  建议用Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物(GSP)用于第一链合成。由于RNA模板存在二级结构,如环状结果,有可能导致GSP无法与模板退火;或SSⅡ反转录酶无法从此引物进行有效延伸。

  目的mRNA中含有强的转录中止位点,可以试用以下方法解决:

  a.将第一链的反应温度提高至50℃。

  b.使用随机六聚体代替Oligo(dT)进行第一链反应。

  3.产生非特异性条带

  用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果RT阴性对照的PCR结果也显示同样条带,则需要用DNase I重新处理样品。

  在PCR反应中,非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。在低于引物Tm 2至5℃的温度下进行退火,降低镁离子或是目的DNA的量将减少非特异性结果的产生。

  由于mRNA剪切方式的不同,根据选择引物的不同将导致产生不同的RT-PCR结果。

  4. 产生弥散(smear)条带

  在PCR反应体系中第一链产物的含量过高

  减少引物的用量

  优化PCR反应条件/减少PCR的循环次数

  在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时,其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增,一般会显示为弥散背景。

  5. 产生大分子量的弥散条带

  大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的

  对于长片段的PCR,建议将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:10(或1:100-1:200)

  6. 在无反转录酶的情况下,对照RNA获得扩增结果

  通常是由于对照RNA中含有痕量DNA而导致的。由于进行体外转录时不可能将所有的DNA模板消除。建议可将第一链cDNA稀释1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影响。

  有可能是引物二聚体的条带

  7. 扩增产物滞留在加样孔中

  有可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。建议将第一链结果至少稀释100倍再进行二次扩增。另外,在二次PCR时使用的退火温度如果比引物的Tm值低5℃,可以将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。

  8. SSⅢ与SSⅡ有何不同?

  具有更高的热稳定性(达50℃)

  具有更长的半衰期(达220分钟)

  对PCR无抑制

  干冰运输

  Tdt活性更低

  9.为什么有人更喜欢用SSⅢ而不是ThermoScript?

  Thermo Script如果保存不当会引起活性很快降低,SSⅢ则更稳定。

  10.为什么使用基因特异性引物(GSP)?

  GSP在扩增低丰度的转录本时是最好的。OligodT引物建议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录;随机引物用于mRNA片段的逆转录。

  11.什么情况下需要使用RNase H?

  在第一轮PCR中RNA/DNA杂合体不能正常变性时

  12.根据不同的目的选择不同的系统:

  目的建议:

  RT与PCR使用不同的引物

  或需要灵活选择PCR DNA聚合酶 两步法RT-PCR系统

  高灵敏度 一步法或两步法RT-PCR系统

  高特异性 含有适当的DNA聚合酶的两步法RT-PCR系统

  或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系统

  高保真度 含有Pfx Taq酶的两步法RT-PCR系统

  长的反转录结果 通常使用两步法RT-PCR系统可达到最佳结果

  含Elongase酶的一步法RT-PCR系统

  二.Gene racer

  1.如何针对Generacer试剂盒设计基因特异性引物(GSP)?

  使用5’或3’RACE试剂都需要至少一条基因特异性引物,您在设计引物时需要注意以下几点要求:

  50-70%的GC含量,以提高引物熔点(Tm);

  23-28个碱基长度,以提高引物特异性;

  降低3’端GC含量,将引物非特异性结合的可能性降至最低;

  2.为什么得不到RACE产物?

  加入Hela对照

  低质量的RNA模板

  逆转录失败,SSII和SSIII非常适用于长模板cDNA的合成

  目的基因丰度太低,可以通过提高PCR的循环次数来解决,建议使用巢式PCR

  目的基因没有表达,可以通过使用两条GSPs来分析cDNA中是否含有目的基因

  目的基因太长而不适合进行反转录,建议使用Gene Racer试剂盒中的Oligo dT来得到全长cDNA,使用随机引物或与模板的5’端尽可能近的GSP进行PCR。

  cDNA模板属于困难模板,可以通过以下方法解决:优化PCR反应参数及反应体系;降低退火温度;使用5-10%的DMSO帮助通过高GC含量区;使用高保真度和高延伸能力的酶进行PCR反应。

  3. RACE的PCR结果有杂带

  RACE PCR杂带或非特异性PCR条带可能是由于以下原因:

  GSP与其他cDNA的非特异性结合会导致在扩增目的产物时得到无关产物。

  Gene Racer引物和c-DNA的非特异性结合会导致产生一端带有Gene Racer引物序列的PCR产物。

  RNA降解。

  PCR管或试剂污染。

  注意:

  杂带一般是因为没有优化PCR条件,可以加入阴性对照来确定。

  4. 得不到全长的5’RACE PCR产物

  CIP反应后的RNA降解产生了新的带有5’磷酸的断裂模板,可以同Gene Racer RNA Oligo连接。一定要小心操作,保证RNA无降解。

  CIP脱磷酸不完全,可以增加反应中CIP的量或减少RNA的量。

  PCR产生了杂带,并不是真正的连接产物,可以使用上述建议优化PCR。

  三.PCR

  在进行PCR时:

  请确保您没有使用过量的起始DNA或者过高浓度的引物,也没有加入过量的Mg2+

  请确保您使用了恰当的退火温度

  请确保您没有使用过量的DNA聚合酶

  四.引物

  1.应该选择哪种纯化方法?

  取决于实验目的和引物的长度;

  2.为什么我订购了50nmol,但是收到却只有40nmol?

  50nmol是起始量;

  3.怎样制备100μM的储液?

  体积(μL)=质检报告上的nmol数目×10;

  4.怎样设计引物?

  一般长度20~30bp;

  至少50%的GC含量;

  避免引物二聚体和二级结构;

  引物对的Tm值应该接近。

  5.引物序列有插入或缺失?

  使用上游和下游引物多测几个克隆。

  请选择正确的纯化方法。

  6. PCR无结果?

  请检查引物设计是否正确;

  请检测OD读数是否正确;

  做一个阳性对照和一个阴性对照

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