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【深度热点】微生物实验操作中常见注意事项汇总!

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2018-11-07 16:24
来源:实验与分析
实验与分析
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  微生物实验容易被污染,所以,对实验环境、设备和人员都需要很高的要求。在实验过程中需要注意的事项也很多,小析姐就其中的几点和大家进行学习。

  无菌操作要求

  1. 接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。

  2. 进行接种食品样品时,必须穿专用的工作服、帽及拖鞋,应放在无菌室缓冲间, 工作前经紫外线消毒后使用。

  3. 接种食品样品时,应在进无菌室前用肥皂洗手,然后用75%酒精棉球将手擦干净。

  4. 进行接种所用的吸管,平皿及培养基等必须经消毒灭菌,打开包装未使用完的器皿,不能放置后再使用,金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。

  5. 从包装中取出吸管时,吸管尖部不能触及外露部位,使用吸管接种于试管或平皿时,吸管尖不得触及试管或平皿边。

  6. 接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作,接种细菌或样品时,吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。

  7. 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝,必要时还要烧到环和针与杆的连接处,接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min,再经火焰烧灼。

  8. 吸管吸取菌液或样品时,应用相应的橡皮头吸取,不得直接用口吸。

  不同型号的接种针和接种环

  无菌间使用要求

  1、无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃,并要密封,不得随意打开,并设有与无菌 间大小相应的缓冲间及推拉门,另设有0.5-0.7平方米的小窗,以备进入无菌间后传递物品。

  2、无菌间内应保持清洁,工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒,擦拭工作台面,不得存放与实验无关的物品。

  3、无菌间使用前后应将门关紧, 打开紫外灯,如采用室内悬吊紫外灯消毒时,需30W紫外灯,距离在1.0m处,照射时间不少于30min,使用紫外灯,应注意不得直接在紫外线下操作,以免引起损伤,灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭,除去上面灰尘和油垢,以减少紫外线穿透的影响。

  4、处理和接种食品标本时,进入无菌间操作,不得随意出入,如需要传递物品,可通过小窗传递。

  5、在无菌间内如需要安装空调时,则应有过滤装置。

  消毒灭菌要求

  微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等,必须经灭菌后方能使用。灭菌方式有干热和湿热高压蒸气锅灭菌方法和间歇灭菌方法

  1、灭菌前准备

  (1)所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干,玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密,如用金属筒应将上面通气孔打开。

  (2)装培养基的三角瓶塞,用纸包好,试管盖好盖,注射器须将管芯抽出,用纱布包好。

  2、装放

  (1)干热灭菌器:装放物品不可过挤,且不能接触箱的四壁。

  (2)大型高压蒸气锅::放置灭菌物品分别包扎好,直接放入消毒筒内,物品之间不能 过挤。

  3、设备检查

  (1)检查门的开关是否灵活,橡皮圈有无损坏,是否平整。

  (2)检查压力表蒸气排尽时是否停留在零位,关好门和盖,通蒸气或加热后,观察是式高压锅或立式压力蒸气灭菌器的使用应按下列步骤进行:

  ①手提式高压锅在主体内加入3L清水,立式高压锅加水16L(重复使用时应将水 量补足,水变混浊需更换).

  ②手提式压力锅将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管中(无软管或软管锈蚀破裂的灭菌器不得使用)。

  ③盖好顶盖拧紧,勿使漏气;置灭菌器于火源上加热,立式压力锅通上电源,并打开顶盖上的排气阀放了冷气(水沸腾后排气10-15min)。

  ④关闭排气阀,使蒸气压上升到规定要求,并维持规定时间(按灭菌物品性质与有关情况而定)。

  ⑤达到规定时间后,对需干燥的物品,立即打开排气阀排出蒸气,待压力恢复到零时,自然冷却至 60℃后开盖取物,如为液体物品,不要打开排气阀,而应立即将锅去除热源,待自然冷却,压力恢复至零,温度降到60℃以下再开盖取物,以防突然减压液体剧烈沸腾或容器爆破。

  (3)卧式压力锅蒸气灭菌器的使用按下列步骤进行:

  ①关紧锅门,打开进气阀,将蒸气引入夹层进行预热,夹层内冷空气经阻气器自动排出。

  ② 夹层达到预定温度后,打开锅室进气阀,将蒸气引入锅室,锅室内冷空气经锅室阻气器自动排出。

  ③待锅室达到规定的压力与温度时,调节进气阀,使保持恒定。

  ④自然或人工降温至60℃再开门取物,不得使用快速排出蒸气法,以防突然降压,液体剧烈沸腾或容器爆破。

  ⑤使用自动程序控制式压力蒸气灭菌器,在放好物品关紧门后,应根据物品类别按 动相应开关,以便按要求程序自动进行灭菌,灭菌时必须利用附设仪表记录温度与时间以备查,操作要求应严格按照厂家说明书进行。

  4、灭菌温度与时间

  压力蒸气灭菌锅灭菌温度与时间见下表:

  (1)干热灭菌器灭菌温度160℃,1.5-2h。

  (2)压力蒸气灭菌 锅灭菌温度与时间。

  间接灭菌方法

  1、灭菌方法系利用不加压力的蒸气灭菌,某些物质经高压蒸气灭菌容易破坏,可用此法灭菌。

  (1)将欲灭菌物品置于锅内,盖上顶盖,打开排水口,使器内余水排尽。

  (2)关闭排水口,打开进气门,根据需要消毒10~20min。

  (3)灭菌完毕关闭进气门,取出物品待冷至室温温度,放入37℃温箱过夜,次日仍按上述方法消毒,如此三次,即可达到灭菌目的。

  2、血清凝固器使用方法,培养基中含有血清或鸡蛋特殊成份时,因高热会破坏其营 养成份,故用低温,可使血清凝固,又可达到灭菌目的。

  (1)在使用该法灭菌的血清等分装时,需严格遵守无菌操作,试管、平皿也经灭菌后使用。

  (2)将培养基按要求使成斜面或高层,加足水后,接上电源,升温75~90℃1h灭菌,放37℃温箱过夜,再如此灭菌三次。

  3、煮沸消毒:可用煮锅或煮沸消毒器,水沸腾后再煮5~15 min,也可在水中加入2%石炭酸煮沸5 min,加入0.02%甲醛,80℃煮60 min均可达到灭菌目的, 但选用 煮沸消毒的增消剂时, 应注意对物品的腐蚀性。

  4、灭菌处理:灭菌后物品,按正常情况已属无菌,从灭菌器中取出应仔细检查放置,以免再度污染。

  (1)物品取出,随即检查包装的完整性,若有破坏或棉塞脱掉,不可作为无菌物品使用。

  (2)取出的物品,如为包装有明显的水浸者,不可作为无菌物品使用。

  (3)培养基或试剂等,应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态,未达到者应废弃。

  (4)启闭式容器,在取出时应将筛孔关闭。

  (5)取出的物品掉落在地或误放不洁这处,或沾有水液,均视为受到污染,不可作为无 菌物品使用。

  (6)取出的合格灭菌物品,应存放于贮藏室或防尘柜内,严禁与未灭菌物品混放。

  (7)凡属合格物品,应标有灭菌日期及有效期限。

  (8)每批灭菌处理完成后,记录灭菌品名、数量、温度、时间、操作者。

  有毒有菌污物处理要求

  微生物实验所用实验器材、培养物等未经消毒处理,一律不得带出实验室。

  1、经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内,并集中存放在指定地点,待统一进行高压灭菌。

  2、经微生物污染的培养物,必须经121℃30min高压灭菌。

  3、染菌后的吸管,使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸液中,最少浸泡24h(消毒液体不得低于浸泡的高度)再经121℃30 min高压灭菌。

  4、涂片染色冲洗片的液体,一般可直接冲入下水道,烈性菌的冲洗液必须冲在烧杯 中,经高压灭菌后方可倒入下水道,染色的玻片放入5%煤酚皂溶液中浸泡24h后,煮沸洗涤。做凝集试验用的玻片或平皿,必须高压灭菌后洗涤。

  5、打碎的培养物,立即用5%煤酚皂溶液或石炭酸液喷洒和浸泡被污染部位,浸泡半小时后再擦拭干净。

  污染的工作服或进行烈性试验所穿的工作服、帽、口罩等,应放入专用消毒袋内,经高压灭菌后方能洗涤。

  培养基制备要求

  培养基制备的质量将直接影响微生物生长。因为各种微生物对其营养要求不完全相同,培养目的的不同,各种培养基制备要求如下:

  1、根据培养基配方的成分按量称取,然后溶于蒸馏水中,在使用前对应用的试剂药 品应进行质量检验。

  2、PH 测定及调节:PH测定要在培养基冷至室温时进行,因在热或冷的情况下,其PH有一定差异,当测定好时,按计算量加入碱或酸混匀后,应再测试一次。培养基 PH值一定要准确,否则会影响微生物的生长或影响结果的观察。但需注意因高压灭菌可 影响一些培养基的 PH 降低或升高,故不宜灭菌压力过高或次数太多,以免影响培养基 的质量,指示剂、去氧胆酸钠、琼脂等一般在调完PH后再加入。

  3、培养基需保持澄清,便于观察细菌的生长情况,培养基加热煮沸后,可用脱脂棉 花或绒布过滤,以除去沉淀物,必要时可用鸡蛋白澄清处理,所用琼脂条要预先洗净晾干后使用,避免因琼脂含杂质而影响透明度。

  4、盛装培养基不宜用铁、铜等容器,使用洗净的中性硬质玻璃容器为好。

  5、培养基的灭菌既要达到完全灭菌目的,又要注意不因加热而降低其营养价值,一般121℃15min即可,如为含有不耐高热物质的培养基如糖类、血清、明胶等,则应采用低温灭菌或间歇法灭菌,一些不能加热的试剂如亚碲酸钾、卵黄、TTC、抗菌素等,待基础琼脂高压灭菌后凉至50℃左右再加入。

  6、每批培养基制备好后,应做无菌生长试验及所检菌株生长试验。如果是生化培养 基,使用标准菌株接种培养,观察生化反应结果,应呈正常反应,培养基不应贮存过久,必要时可置4℃冰箱存放。

  7、目前各种干燥培养基较多,每批需用标准菌株进行生长试验或生化反应观察,各种培养基用相应菌株生长试验良好后方可应用,新购进的或存放过久的干燥培养基,在配制时也应测PH,使用时需根据产品说明书用量和方法进行。

  8、每批制备的培养基所用化学试剂、灭菌情况及菌株生长试验结果、制作人员等应做好记录,以备查询。

  样品采集及处理要求

  1、所采集的检验样品一定要具有代表性,采样时应首先对该批食品原料、加工、运输、贮藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查,检查是否有污染源存在。

  2、根据食品的种类及数量,采样数量及方法应按标准检验方法的要求进行。

  3、采样应注意无菌操作,容器必须灭菌,避免环境中微生物污染,容器不得使用煤酚皂溶液,用新洁尔灭、酒精等消毒药物灭菌,更不能含有此类消毒药物或抗生素类药物,以避免杀死样品中的微生物,所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可应用。

  4、样品采集后应立即送往检验室进行检验,送检过程中一般不超过3h,如路程较远,可保存在1~5℃环境中,如需冷冻者,则在冻存状态下送检。

  5、检验室收到样品后,进行登记(样品名称、送检单位、数量、日期、编号等),观察样品的外观,如果发现有下列情况之一者,可拒绝检验。

  (1)样品经过特殊高压、煮沸或其他方法杀菌者,失去代表原食品检验意义者。

  (2)瓶、袋装食品已启开者,熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎不完整者,即失去原食品形状者(食物中毒样品除外)。

  (3)按规定采样数量不足者。

  对送检符合要求的样品, 检验室收到后,应立即进行检验,如果条件不具备,应置4℃冰箱存放,及时准备创造条件,然后进行检验。

  6、样品检验时,根据其不同性状,进行适当处理。

  (1)液体样品接种时,应充分混合均匀,按量吸取进行接种。

  (2)固体样品,用灭菌刀、剪取其不同部位共25g,置于225ml 灭菌生理盐水或其他溶液中,用均质器搅碎混匀后,按量吸取接种。

  (3)瓶、袋装食品应用灭菌操作启开,根据性状选择上述方法处理后接种。

  记录和报告的要求

  1、检验室收到样品后,首先进行外观检验,及时按照国家标准检验方法进行检验, 检验过程中要认真、负责、严格进行无菌操作,避免环境中微生物污染。

  2、样品检验过程中所用方法、出现的现象和结果等均要用文字写出试验纪录,以作为对结果分析、判定的依据,记录要求详细、清楚、真实、客观、不得涂改和伪造。

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