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【纯化】蛋白纯化的三种新工具

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2017-07-20 09:25
来源:互联网
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  蛋白亲和标签是蛋白质组研究中的一个关键性工具。迄今为止,人们已经开发出了许多久经考验的蛋白标签系统,例如六聚组氨酸、HA、Myc和FLAG等等。尽管这些标签系统各具特色,但它们也分别存在着一些缺陷,还无法完全满足研究者们的需求。

  为此,Biotechniques杂志盘点了近期出现的三种新蛋白标签系统,以便为研究者们提供更大的选择空间。这三种蛋白便签系统分别利用了高亲和力单抗、无机矿物基质以及能够剪切标签的金属离子。

  单克隆抗体标签

  日本研究者Yukinari Kato在开发胶质母细胞瘤的治疗性抗体时,无意中发现了一个可用作亲和标签的肽段。Podoplanin蛋白是一个在恶性癌细胞中高度表达的跨膜蛋白,Kato生成的大鼠单克隆抗体NZ-1可以靶向该蛋白中一个14个残基的肽段。Kato在ELISA实验中注意到,NZ-1与Podoplanin蛋白的亲和力特别高,于是,他与大阪大学的Junichi Takagi合作,希望将其开发成为一个蛋白标签系统。

  据介绍,这一系统的关键优势在于,可以在无损抗体柱的情况下很方便地进行再生。研究显示,高盐缓冲液可以完全去除结合在抗体上的PA标签,进行60次结合-洗脱-再生循环,也不会对柱子的结合能力产生任何影响。

  目前,上述系统还不能兼容人类细胞。“我们正在晶体结构的引导下,设计不识别人类Podoplanin的改进版NZ-1,只保留它与标签肽段的高亲和力,”Takagi说。他现在正努力将这一标签系统应用到蛋白质组分析中去,希望能够用其替代FLAG标签。

  磷灰石基质

  人们常常用固化的抗体和金属离子来纯化重组蛋白,不过这些方案并不完美,存在着金属离子析出、稳定性低和成本高等问题。为此,Jacobs大学的Marcelo Fernandez-Lahore用无机矿物氟磷灰石,开发了一个新的亲和标签纯化系统。

  Fernandez-Lahore实验室在这种材料的基础上,开始寻找与氟磷灰石高度亲和的标签肽段。研究人员通过噬菌体展示筛选,发现肽段KPRSVSG与CFT的结合能力很强,于是他们决定将这个CFT结合肽段(CBP)开发成为蛋白纯化的亲和标签。

  研究人员指出,与使用固化抗体或金属离子的传统系统相比,CBP/CFT株组成的系统可以弥补一些缺陷,是蛋白亲和纯化的另一条宝贵途径。未来,研究人员将会用这一系统,对不同大小、不同特性、不同表达系统(例如哺乳动物或酵母表达系统)的蛋白进行测试。Fernandez-Lahore还指出,这一标签可以“实现可逆的固化,有望应用于医学诊断或细胞分析。”

  二合一系统

  尽管许多蛋白与亲和标签融合后也能够正常工作,但不少实验还是要求去除这些标签。人们往往将剪切位点设计在蛋白标签旁边,以便用蛋白酶消化时能够将其切下来。

  为了进一步简化这一过程,哥本哈根大学的Niels ErikMøllegaard提出了一个有趣的新标签系统。在该系统中,一个分子可以同时实现亲和结合和蛋白标签的剪切,这个分子就是二价铀酰离子(UO22+)。

  四年前研究团队发现,铀酰可以在蛋白中对磷酸化的丝氨酸进行光切割。研究人员随即想到,可以合成一个包含特异性磷酸化位点的标签,使其与固化的铀酰离子结合,该系统可以在光切割后释放出纯化的无标签重组蛋白。

  现在,Møllegaard正在尝试对结合在铀酰-NTA-琼脂糖珠上的融合蛋白进行光切割,以便将其发展成为蛋白分离和标签切除的一步法系统。“还有许多步骤有待优化,举例来说,我们需要优化紫外线照射,以便在纯化柱上进行更有效的光切割,”Møllegaard指出。

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