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    应用PCR技术检测沙门氏菌

    作者:Martine Simon等 文章来源:BAV卫生和质量保证研究所,BIOTECON诊断技术有限公司  点击数:6098  发布时间:03-19
    Offenbach市的BAV研究所23个月共检测28000多份食品样本。他们使用了自动制备样本的设备,并采用实时定量PCR技术。以至于能更快的完成食品样本的检测,也大大减少了出错率。

    用于食品中沙门氏菌的快检方法

    Offenbach市的BAV研究所23个月共检测28000多份食品样本。他们使用了自动制备样本的设备,并采用实时定量PCR技术。以至于能更快的完成食品样本的检测,也大大减少了出错率。

     

    图1.(按照ISO 6579标准)用分子生物学和微生物学分别对沙门氏菌进行检测方法比较。

     

    实时定量PCR(聚合酶链式反应)技术是一种检测沙门氏菌的快速、可靠的方法。与传统的经典方法不同,使用分子生物学技术后此法能够明显缩短沙门氏菌的检测时间。可以说,实时定量PCR法是能够满足不断增长的食品安全检测需求的快捷方法。通过把DNA目标分子引物和探针结合在一起的特殊方法,使得实时定量PCR技术有着很高的灵敏度。

    Biotecon公司foodproof系列产品已经有15年历史了,已成为食品领域中用来实时定量检测食源性病原体的重要产品,为食品实验室提供了自动化检测的可能性。该公司的常规检验方法和自动化样本制备设备都在合作伙伴BAV卫生和质量保证研究所经过了长期的测试检验。

    BAV卫生和质量保证研究所是德国最大的、最现代化的食品微生物检测实验室,在德国约有1000多家企业客户。除了对食品进行检验、测试外,也对药品、化妆品生产领域中的样本进行检验。其中,重要病原体中最常被检验的就是沙门氏杆菌种。这种革兰氏阴性的沙门氏杆菌属于肠杆菌科的病原体,会导致人类患上沙门氏菌病(德国最常见的食源性疾病)。

    接下来介绍在foodproof Roboprep+ HT150-8机器人的帮助下,使用foodproof Salmonella试剂盒结合foodproof磁珠法进行沙门氏菌的常规检测。

    早在2013年时,病原体检测的实时定量PCR技术就通过Microval获得了ISO16140标准和AOAC-RI认证。

     

    图2.BAV公司利用自动化DNA提取设备和实时定量聚合酶链式反应技术检测沙门氏菌的食品类型百分比。

     

    使用的材料和方法

    2012年7月至2014年5月期间,BAV研究所对28490份样本进行了沙门氏菌病原体的检测。除了肉、肠类样品外,也包括沙拉,甜点,冰淇淋,熟食和鱼类产品的样本(见图1)。

    样本富集和DNA提取

    样本富集时将25g被测样本原料与225ml的缓冲蛋白胨水混合在一起,在37℃的恒温器中培育19~20h;然后抽取8ml悬浮液注入离心管中。为满足大批量样本制备的需求,BAV公司实验室采用了自动化DNA提取设备:foodproof RoboPrep+HT 150-8型机器人和foodproof磁珠法沙门氏菌试剂盒。

    沙门氏菌的检验

    使用foodproof沙门氏菌试剂盒、杂交探针和Roche LightCycler 480实时荧光定量PCR仪检测病原体。整套装备中含有放大控制器,以便保证阴性PRC检测结果的正确性。如图1所示的检测流程,从样本富集开始到得出检测结果为止,时间可缩短到24h以内,阳性样本结果最后还要通过传统方法再次核实。要知道,如果使用ISO 6579标准中的参考方法,进行沙门氏菌检测的话,至少需要三天,阳性样本则至少四天。

     

    结果

    在这28490份食品样本中,有237份样本没有得出明确的检测结果,需要使用传统方法再次检验。这就意味着有99.17%的样本可以用分子生物学方法进行检验;有159份样本检验结果呈阳性,随后按照ISO 6579标准中规定的传统方法对这些样本进行了核查,大部分样本(n=97)的核实结果与分子生物学的PCR阳性结果相符;只有62份样本无法证实为PCR阳性的检验结果,相当于样本总量的0.21%(参见表1)。利用foodproof沙门氏菌试剂盒检测结果的放大曲线参见图3。

    表1.利用foodproof沙门氏菌试剂盒对不同食品样本进行检测的结果

     

    月份 

     

    百分比

    可疑的实时定量聚合酶链式检验结果(未用传统方法核实)

    数量 

    单位 %

    07/2012

    1301

    2

    0,15

    08/2012

    1119

    5

    0,45

    09/2012

    1036

    6

    0,58

    10/2012

    1151

    2

    0,17

    11/2012

    1033

    1

    0,10

    12/2012

    706

    1

    0,14

    01/2013

    1069

    3

    0,28

    02/2013

    1176

    3

    0,26

    03/2013

    1530

    1

    0,07

    04/2013

    1319

    0

    0,00

    05/2013

    1152

    1

    0,09

    06/2013

    1255

    0

    0,00

    07/2013

    1304

    1

    0,08

    08/2013

    1495

    7

    0,47

    09/2013

    1196

    3

    0,25

    10/2013

    1022

    4

    0,39

    11/2013

    1401

    0

    0,0

    12/2013

    980

    2

    0,20

    01/2014

    1228

    1

    0,08

    02/2014

    1462

    5

    0,34

    03/2014

    1638

    4

    0,24

    04/2014

    1471

    5

    0,34

    05/2014

    1445

    5

    0,35

    Total

    28.490

    62

    ∅0.21

     

    图3.发现沙门氏菌的放大曲线(上)和内部监控情况(下)。

     

    讨论

    foodproof沙门氏菌试剂盒是食品检测中非常可靠的快检方法。美国能力验证研究所发表了一份关于在微生物食品检测实验室间假阳性结果数量研究的比对测试。报告中采集的是1999年到2012年间的数据。研究表明:此间只有4.9%的沙门氏菌检测样本被评定为假阳性结果。从2012年7月到2014年5月,BAV公司检测数据表明:只有0.21%的样本结果与使用传统方法的结果不同,只有≤2%的样本无法检验。Microval和AOAC的验证数据也表明:foodproof沙门氏菌试剂盒检测结果正确性约98%。

    这都说明实时定量聚合酶链式反应技术在食品领域中的检测结果是可靠的。

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